《生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用》是在第四版的基礎(chǔ)上，結(jié)合近幾年來科學(xué)進(jìn)展修訂而成。《生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用》共分3編，20章：第一編概述蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子物質(zhì)的制備方法及基本要點(diǎn)；第二編講解從動(dòng)物、植物和微生物材料中分離純化上述物質(zhì)的常見方法，如離子交換層析、疏水層析、親和層析、聚焦層析、凝膠過濾、高效液相色譜、沉淀法等；第三編介紹鑒定生命大分子物質(zhì)所涉及的相關(guān)方法，如同位素標(biāo)記(包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)的標(biāo)記)、基因重組、DNA序列測(cè)定、生物芯片、聚合酶鏈反應(yīng)（包括DNA和RNA的擴(kuò)增）、電泳（包括各種聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳等)、免疫分析(包括多克隆和單克隆抗體的制備、免疫擴(kuò)散、各種免疫電泳、固相免疫吸附法——酶聯(lián)免疫吸附法和免疫印跡法等)、薄層與薄膜層析、氣相色譜、分光光度法和離心法等。《生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用》在闡明各類方法基本原理的同時(shí)，還講述了主要操作、注意事項(xiàng)及應(yīng)用實(shí)例，在每章末尾附有思考題和主要參考文獻(xiàn)，《生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用》共有圖、表360余幅。
《生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用》適合綜合性大學(xué)及醫(yī)、農(nóng)、師范院校等相關(guān)專業(yè)本科生和研究生使用，還可供從事生物科學(xué)工作的有關(guān)人員參考。
第五版前言
第四版前言
第三版前言
第一編概述
第一章 生命大分子物質(zhì)的制備2
第一節(jié) 材料的選擇與處理2
一、材料的選擇2
二、材料的處理3
第二節(jié) 測(cè)定方法的確立4
一、目的與要求4
二、常用的測(cè)定方法4
第三節(jié) 細(xì)胞破碎7
一、機(jī)械破碎7
二、溶脹和自溶8
三、化學(xué)處理8 第五版前言
第四版前言
第三版前言
第一編概述
第一章 生命大分子物質(zhì)的制備2
第一節(jié) 材料的選擇與處理2
一、材料的選擇2
二、材料的處理3
第二節(jié) 測(cè)定方法的確立4
一、目的與要求4
二、常用的測(cè)定方法4
第三節(jié) 細(xì)胞破碎7
一、機(jī)械破碎7
二、溶脹和自溶8
三、化學(xué)處理8
四、生物酶降解8
第四節(jié) 抽提9
一、抽提的含義9
二、抽提有效成分的影響因子9
第五節(jié) 濃縮12
一、沉淀法12
二、吸附法12
三、超過濾法12
四、透析法13
五、離心法13
六、干燥法13
第六節(jié) 純化方案的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)14
一、純化方案的設(shè)計(jì)14
二、純化方案的評(píng)價(jià)15
第七節(jié) 有效成分純度和性質(zhì)的分析16
第八節(jié) 應(yīng)用實(shí)例16
一、高純度人轉(zhuǎn)鐵蛋白的制備16
二、葉綠體的提取與45SRNA的制備16
三、細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取17
思考題17
參考文獻(xiàn)17
第二編純化方法
第二章 沉淀法20
第一節(jié) 基本原理與沉淀類型20
一、基本原理20
二、制備蛋白質(zhì)20
三、制備核酸29
第二節(jié) 應(yīng)用實(shí)例32
一、脾磷酸二酯酶的純化32
二、細(xì)菌染色體DNA的制備32
三、蔗糖酶的初步純化33
思考題33
參考文獻(xiàn)34
第三章 吸附層析35
第一節(jié) 吸附柱層析36
一、常用術(shù)語36
二、基本原理37
三、吸附劑38
四、洗脫液41
五、層析柱的制備與層析操作41
六、應(yīng)用與實(shí)例43
第二節(jié) 薄層層析45
一、操作及注意事項(xiàng)46
二、應(yīng)用實(shí)例51
第三節(jié) 聚酰胺薄膜層析52
一、基本原理52
二、應(yīng)用實(shí)例53
思考題56
參考文獻(xiàn)57
第四章 疏水層析58
第一節(jié) 基本原理58
一、疏水作用58
二、吸附劑59
第二節(jié) 操作與應(yīng)用59
一、層析柱的制備59
二、加樣與洗脫60
三、應(yīng)用實(shí)例60
思考題62
參考文獻(xiàn)62
第五章 離子交換層析63
第一節(jié) 基本原理63
第二節(jié) 離子交換劑的分類及性質(zhì)65
一、分類65
二、性質(zhì)71
第三節(jié) 離子交換劑與緩沖液的選擇78
一、離子交換劑的選擇78
二、緩沖液的選擇79
三、加樣量的確定82
第四節(jié) 操作82
一、離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型82
二、分離物質(zhì)的交換83
三、物質(zhì)的洗脫與收集84
第五節(jié) 應(yīng)用86
一、制備、純化生命物質(zhì)86
二、測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)89
思考題89
參考文獻(xiàn)90
第六章 凝膠過濾91
第一節(jié) 凝膠的分類及性質(zhì)91
一、葡聚糖凝膠92
二、瓊脂糖凝膠94
三、聚丙烯酰胺凝膠95
四、Sephacryl96
五、Superdex97
第二節(jié) 基本原理97
第三節(jié) 操作100
一、凝膠的選擇和處理100
二、凝膠柱的制備101
三、加樣與洗脫102
四、凝膠柱的再生及保存106
第四節(jié) 應(yīng)用106
一、脫鹽和濃縮106
二、分離生命物質(zhì)107
三、去除熱源物質(zhì)108
四、測(cè)定分子質(zhì)量108
五、其他111
思考題111
參考文獻(xiàn)111
第七章 親和層析112
第一節(jié) 基本原理112
第二節(jié) 操作114
一、載體的選擇114
二、配體的選擇115
三、親和吸附劑的制備116
四、特異性吸附118
五、分離大分子物質(zhì)120
六、親和層析柱的再生121
第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量121
一、在配體和載體間引入“手臂”121
二、增加配體取代的程度123
三、配體與載體衍生物以最少的鍵連接123
四、載體多孔性的影響123
五、其他124
第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例124
一、純化大分子物質(zhì)124
二、研究酶的結(jié)構(gòu)與功能127
三、實(shí)例128
思考題131
參考文獻(xiàn)131
第八章 聚焦層析132
第一節(jié) 基本原理132
一、多緩沖劑和多緩沖交換劑132
二、聚焦層析原理133
第二節(jié) 操作136
一、多緩沖劑的選擇136
二、多緩沖交換劑用量的確定136
三、多緩沖交換劑的處理137
四、樣品的準(zhǔn)備137
五、加樣和洗脫137
六、樣品中多緩沖劑的去除138
第三節(jié) 應(yīng)用138
一、分離模型蛋白質(zhì)138
二、分離復(fù)雜物質(zhì)139
三、鑒定某些酶的性質(zhì)140
思考題141
參考文獻(xiàn)141
第九章 高效液相色譜142
第一節(jié) 基本原理143
一、高效液相色譜儀143
二、固定相145
第二節(jié) 反相高效液相色譜148
一、固定相、流動(dòng)相和色譜柱149
二、純化糖基化白蛋白肽片段151
第三節(jié) 應(yīng)用153
一、定性和定量分析153
二、測(cè)定酶活性154
三、測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量154
四、分離核酸和蛋白質(zhì)155
思考題160
參考文獻(xiàn)160
第十章 固定化的酶與微生物161
第一節(jié) 制備方法162
一、固定化酶162
二、固定化微生物165
三、生物傳感器166
第二節(jié) 制品的性質(zhì)167
一、酶的相對(duì)活性167
二、活性曲線與最適pH168
三、穩(wěn)定性169
四、米氏常數(shù)170
五、其他170
第三節(jié) 應(yīng)用實(shí)例171
一、工業(yè)方面171
二、醫(yī)學(xué)方面174
三、生化分析方面175
四、應(yīng)用實(shí)例177
思考題179
參考文獻(xiàn)179
第三編鑒定方法
第十一章 標(biāo)記182
第一節(jié) 核酸標(biāo)記182
一、基本原理182
二、標(biāo)記方法183
第二節(jié) 蛋白質(zhì)標(biāo)記189
一、機(jī)制190
二、類型190
三、標(biāo)記物制備191
第三節(jié) 標(biāo)記物的純化與鑒定195
一、標(biāo)記物純化196
二、探針的鑒定197
第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例201
一、cDNA組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)201
二、激酶的磷酸化和脫磷酸化205
三、蛋白質(zhì)半衰期的測(cè)定206
思考題207
參考文獻(xiàn)207
第十二章 重組DNA208
第一節(jié) 重組DNA的部件208
一、工具酶208
二、載體211
三、目的基因213
第二節(jié) 重組218
一、黏性末端連接法219
二、平端連接法220
三、平黏連接法221
四、TA連接法221
五、同聚物加尾連接法221
六、人工接頭連接法221
第三節(jié) DNA擴(kuò)增223
一、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞223
二、重組子的篩選與鑒定225
三、表達(dá)產(chǎn)物的純化227
第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例227
一、分離總RNA和mRNA228
二、反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA228
三、PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物純化228
四、PCR產(chǎn)物的克隆229
五、重組質(zhì)粒的提取及分析229
思考題230
參考文獻(xiàn)230
第十三章 DNA序列測(cè)定231
第一節(jié) 雙脫氧鏈終止法231
一、基本原理231
二、載體系統(tǒng)232
三、測(cè)序試劑236
四、測(cè)序操作238
五、變性電泳241
六、序列讀取242
第二節(jié) PCR法242
一、直接測(cè)序243
二、循環(huán)測(cè)序244
三、應(yīng)用實(shí)例245
第三節(jié) 化學(xué)降解法246
一、測(cè)序原理246
二、具體操作247
第四節(jié) 新一代測(cè)序法250
一、第二代測(cè)序法250
二、第三代測(cè)序法252
思考題253
參考文獻(xiàn)253
第十四章 生物芯片254
第一節(jié) 基因芯片254
一、基本原理和工作流程254
二、制備及操作257
三、應(yīng)用實(shí)例262
第二節(jié) 蛋白質(zhì)芯片267
一、原理及特點(diǎn)267
二、制備與操作268
三、應(yīng)用實(shí)例270
第三節(jié) 芯片實(shí)驗(yàn)室273
一、結(jié)構(gòu)與制作273
二、應(yīng)用實(shí)例276
思考題282
參考文獻(xiàn)282
第十五章 聚合酶鏈反應(yīng)283
第一節(jié) 基本原理及操作系統(tǒng)283
一、擴(kuò)增DNA283
二、擴(kuò)增RNA290
第二節(jié) PCR的類型294
一、普通PCR294
二、原位PCR295
三、反轉(zhuǎn)錄PCR295
四、反向PCR295
五、不對(duì)稱PCR296
六、巢式PCR296
七、彩色PCR297
第三節(jié) 應(yīng)用297
一、篩選目的基因297
二、直接測(cè)序297
三、標(biāo)記DNA探針298
四、尋找新基因298
五、檢測(cè)血液和組織成分298
六、檢測(cè)環(huán)境中的致病菌與指示菌298
思考題299
參考文獻(xiàn)299
第十六章 電泳300
第一節(jié) 基本原理301
一、泳動(dòng)度概念301
二、影響泳動(dòng)度的因子302
第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳303
一、基本原理303
二、不連續(xù)垂直板狀和柱狀凝膠電泳309
三、連續(xù)的垂直板凝膠的電泳319
四、線性和階梯式梯度的板狀凝膠電泳320
五、雙向電泳322
第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳323
一、緩沖液的配制324
二、瓊脂糖膠板的制備324
三、加樣和電泳325
四、觀察325
第四節(jié) 應(yīng)用325
一、測(cè)定分子質(zhì)量326
二、測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)328
三、鑒定微量物質(zhì)333
四、診斷疾病（轉(zhuǎn)移電泳）336
思考題339
參考文獻(xiàn)339
第十七章 免疫分析340
第一節(jié) 抗體的性質(zhì)、制備及純化340
一、抗體的性質(zhì)340
二、多克隆抗體的制備341
三、單克隆抗體的制備346
四、抗體的檢測(cè)350
五、抗體的純化352
第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)與應(yīng)用354
一、凝集反應(yīng)354
二、免疫擴(kuò)散357
三、免疫電泳359
四、固相免疫吸附（含ELISA）363
五、免疫微球測(cè)定370
思考題372
參考文獻(xiàn)373
第十八章 氣相色譜374
第一節(jié) 基本原理374
一、常用術(shù)語374
二、塔板與速率理論376
第二節(jié) 氣相色譜儀的構(gòu)造379
一、載氣流速的控制和測(cè)量380
二、進(jìn)樣系統(tǒng)380
三、恒溫室380
四、色譜柱380
五、檢定器384
第三節(jié) 操作385
一、操作要點(diǎn)385
二、條件的選擇386
第四節(jié) 定性和定量檢測(cè)386
一、定性檢測(cè)386
二、定量檢測(cè)387
第五節(jié) 應(yīng)用390
一、分析蛋白質(zhì)和氨基酸390
二、分析核酸391
三、分析糖類物質(zhì)391
四、分析脂肪酸392
五、分析農(nóng)藥392
思考題392
參考文獻(xiàn)392
第十九章 分光光度法393
第一節(jié) 基本原理393
一、光譜393
二、物質(zhì)結(jié)構(gòu)與光譜的關(guān)系394
三、光吸收的基本規(guī)律——比爾朗伯定律396
第二節(jié) 分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及類型397
一、主要結(jié)構(gòu)397
二、類型400
第三節(jié) 應(yīng)用402
一、定性分析402
二、含量測(cè)定404
三、參數(shù)測(cè)定409
四、物質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析410
思考題410
參考文獻(xiàn)411
第二十章 離心法412
第一節(jié) 基本原理412
一、沉降現(xiàn)象412
二、離心力413
三、離心法413
四、沉降系數(shù)415
第二節(jié) 離心機(jī)的類型及構(gòu)造416
一、制備型離心機(jī)416
二、分析型離心機(jī)419
第三節(jié) 應(yīng)用419
一、離心機(jī)的操作概述419
二、應(yīng)用實(shí)例421
三、測(cè)定沉降系數(shù)423
四、分離純化生命物質(zhì)424
思考題424
參考文獻(xiàn)425
參考文獻(xiàn)426
附錄435
中英文縮寫詞448
第一編 概述
第一章 生命大分子物質(zhì)的制備
生命大分子物質(zhì)通常是指動(dòng)物、植物和微生物在進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝時(shí)，所形成的蛋白質(zhì)(包括酶)和核酸等有機(jī)化合物的總稱。它不僅是一些生物科學(xué)工作者研究、探索的主要對(duì)象，還與廣大從事化工、醫(yī)學(xué)和食品等學(xué)科的人員密切相關(guān)。在這些方面，特別是科研方面，隨著人類基因組的30億堿基對(duì)測(cè)序工作的完成，生命科學(xué)研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代(研究的焦點(diǎn)將從基因的序列轉(zhuǎn)移到功能方面)。為鑒定大量未知蛋白質(zhì)(酶)的結(jié)構(gòu)和功能，蛋白質(zhì)研究也將進(jìn)入一個(gè)空前活躍的時(shí)期，因此分離純化和測(cè)試分析蛋白質(zhì)技術(shù)顯得十分重要。首先，蛋白質(zhì)與核酸(包括DNA、rRNA、mRNA和tRNA等)相比，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(包括一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu))更具有奇妙獨(dú)特的復(fù)雜性和藝術(shù)性。它是由20多個(gè)不同性質(zhì)(或極性)的氨基酸交互排列而成，不但潛在的數(shù)量多(約100億個(gè))，而且相互間差異大。而核酸的結(jié)構(gòu)，雖然也有異乎尋常的多樣性，但是，它是由結(jié)構(gòu)相似、理化性質(zhì)接近的4個(gè)堿基交互排列而成的，且有一定規(guī)律可循。相對(duì)而言，蛋白質(zhì)的分離、純化和鑒定有較大的難度和特殊性。而核酸的分離、制備和鑒定則比較容易，有捷徑可走。其次，蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)通常是與自然界存在的諸多不同化合物結(jié)合在一起，或者是不同蛋白質(zhì)、不同核酸自身相互組合在一起出現(xiàn)的，加之它們穩(wěn)定性較差(如離體后的多數(shù)酶)、含量相對(duì)偏低，使提取分離過程變得更加困難。最后，提取生命物質(zhì)的材料五花八門、千變?nèi)f化，所用的方法通用性較差，尤其是提取分離蛋白質(zhì)的方法更是如此，這也給制備工作帶來了麻煩和困惑。盡管如此錯(cuò)綜復(fù)雜，卻也不是無軌跡可尋。另外，在實(shí)踐中，確實(shí)非常需要一定純度或較高純度的生命大分子物質(zhì)。因此，人們?cè)诩?xì)心觀察、認(rèn)真歸納制備這些物質(zhì)的程序時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了不少類似操作和共同點(diǎn)，對(duì)制備生命大分子物質(zhì)很有裨益。本章將以蛋白質(zhì)和核酸為主線討論其制備的共有特質(zhì)和一般過程，其中包括材料的選擇與處理、測(cè)定方法的確立、有效成分的抽提、粗品的純化和純品的鑒定(分別見后面各編評(píng)述)等相關(guān)步驟。
第一節(jié) 材料的選擇與處理
一、材料的選擇在進(jìn)行材料的選擇時(shí)，常會(huì)提及有效成分一詞。所謂有效成分是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其他物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。在動(dòng)物、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般較少，如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬分之一。此外，有效成分穩(wěn)定性較差，大多數(shù)對(duì)酸、堿、高溫和高濃度有機(jī)溶劑等因子較敏感，而且容易被微生物分解變質(zhì)。因此，提取有效成分的成功與否，與選用的材料關(guān)系密切。如果選用的材料不同，有效成分的含量就不一樣；選用的材料即使相同，但是部位、生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)地區(qū)或存放時(shí)間不同，有效成分的含量也不盡相同。總的來說，材料選擇應(yīng)遵循的原則是：有效成分含量多、穩(wěn)定性好；來源豐富、保持新鮮；提取容易、工藝簡(jiǎn)單；雜質(zhì)有綜合利用價(jià)值等。在實(shí)踐過程中則需抓主要矛盾，全面考慮，綜合權(quán)衡。例如，胰島素，從含量看，在牛胰臟中比豬的高，但從我國(guó)實(shí)際出發(fā)，全國(guó)豬的飼養(yǎng)頭數(shù)遠(yuǎn)比牛多，加之牛可拉車、耕田，因此制備胰島素一般不選用牛胰臟而選用豬胰臟作材料。磷酸單酯酶，就含量而言，雖然在胰臟、肝臟和脾臟中較豐富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進(jìn)行提純時(shí)，這兩種酶很難分開，所以實(shí)踐中常選用含磷酸單酯酶少、幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。
二、材料的處理
選擇到合適的材料后，應(yīng)及時(shí)使用，否則所需的有效成分會(huì)部分甚至全部被破壞變性，從而影響收得率。例如，從豬腸黏膜提取肝素時(shí)，如果用新鮮材料，每千克小腸可得肝素鈉5萬～6萬U。如將材料置25℃以上的室溫存放約1h，肝素鈉的含量會(huì)顯著下降。其原因是，豬小腸內(nèi)的大量微生物(2 5×108～3×108個(gè)/g)不停地繁殖(如大腸桿菌約20min繁殖一次)，有的會(huì)產(chǎn)生降解肝素的酶系。若選擇的材料難于立即使用時(shí)，一般應(yīng)采用冰凍或干燥等方法處理，同時(shí)還應(yīng)將易于去掉的非需物質(zhì)(如脂類)除去。因常選用的動(dòng)物、植物和微生物材料的特性各異，故處理要求也不完全相同。
（一） 動(dòng)物臟器
1 冰凍從剛宰殺的牲畜得到的臟器(腦組織、心臟等)要迅速剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，立即沖洗干凈。若不能馬上抽提、純化時(shí)，應(yīng)及時(shí)移至-10℃冰庫(可短時(shí)間保存)或-70℃低溫冰箱(數(shù)月不變質(zhì))貯存。
臟器中常含有較多的脂肪，該物質(zhì)不僅容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)，還會(huì)影響純化操作和制品得率。脫脂操作可在提純前進(jìn)行，也可在提純過程中進(jìn)行，具體實(shí)施應(yīng)視材料而定。一般脫脂的方法有：人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑(如丙酮、乙醚)中脫脂；采用快速加熱(50℃左右)、快速冷卻的方法，使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去；利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離。
2 干燥
對(duì)于像腦下垂體一類的小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉貯存?zhèn)溆茫粚?duì)于含耐高溫有效成分(如肝素)的腸黏膜，可在沸水中蒸煮處理，烘干后能長(zhǎng)期保存。
（二）植物組織
由室內(nèi)栽培或野外采集的植物材料，若是植物(如菠菜、芹菜)的葉片，需用清水洗凈方可使用，或置-30～-4℃冰箱貯藏，可在10h內(nèi)使用；若是植物的種子，則需泡脹或粉碎后才可使用。如材料中含油脂較多時(shí)，也要進(jìn)行脫脂處理。
（三）微生物
由于微生物具有種類多、繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)便、誘變?nèi)菀缀筒皇芗竟?jié)影響等優(yōu)點(diǎn)，因此，它已成為制備生命大分子物質(zhì)的主要材料之一。當(dāng)選用的微生物接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液培養(yǎng)一段時(shí)間后，用離心法收集到的上清液，即可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分。而收集到的菌體，經(jīng)破細(xì)胞處理后則可從中提取其他有效成分，如胞內(nèi)酶。前者可置低溫下短時(shí)間貯存，后者可制成凍干粉，在4℃保存。例如，收集的黃桿菌(Flavobacterium sp.)P32細(xì)胞，用0 05mol/L TrisHCl緩沖液(pH7 5)洗兩次，進(jìn)行凍干處理可得到紅棕色的干粉。將其置4℃保存3個(gè)月，檢測(cè)降解對(duì)硫磷水解酶活力的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)無明顯影響。
第二節(jié) 測(cè)定方法的確立
一、目的與要求當(dāng)純化的對(duì)象即某一有效成分選定后，首先碰到的問題是，此物質(zhì)在哪些材料中含有？哪些材料中含量較豐富？其次是在從選定的材料提純此物質(zhì)的過程中，雜質(zhì)是否逐漸減少？純度是否逐漸增加？也就是說，所用的純化方案是基本合理或部分合理，還是根本不妥？要回答這些問題，就必須確立一種專一、靈敏和簡(jiǎn)便快速的測(cè)定方法。不然，很難對(duì)其作出準(zhǔn)確、定量的判斷。
第一節(jié)提到，有效成分在原材料中含量較低。這一事實(shí)決定了抽提液和純化的前一階段溶液中有效成分的比活性較小，加之此時(shí)測(cè)定的樣品很多(每一步驟都須測(cè)定)，因而確立的測(cè)定方法應(yīng)簡(jiǎn)單、靈敏、省時(shí)、快速，除此之外，還要有較好的專一性，否則，所測(cè)得的結(jié)果誤差大，不可靠。例如，在從原料中純化某一酶蛋白時(shí)，測(cè)定其含量的依據(jù)常常是在酶與底物反應(yīng)后，以產(chǎn)物形成或底物降低的數(shù)量來表示的。若選擇的底物是非專一性的，或者選擇的產(chǎn)物不是待測(cè)酶特異催化形成的，這樣測(cè)出的數(shù)值就包含有原料中雜質(zhì)所消耗的底物或形成的產(chǎn)物，影響了酶活性的真實(shí)性。
二、常用的測(cè)定方法
（一）光譜法由于不同生命大分子物質(zhì)與相應(yīng)波長(zhǎng)的光會(huì)發(fā)生特定的作用，而依據(jù)作用結(jié)果即可推斷出被測(cè)物質(zhì)的含量和部分理化性質(zhì)。人們稱這類測(cè)定方法為光譜法。該法通常包括紫外光譜法、可見光光譜法、熒光光譜法和濁度法等。紫外光譜法是利用某些生物大分子物質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)而建立的一種方法；可見光光譜法是利用生命大分子物質(zhì)的一些特殊結(jié)構(gòu)先與相關(guān)試劑反應(yīng)生成不同顏色后，借助可見光檢測(cè)物質(zhì)而建立的一種方法；熒光光譜法是利用有些生命大分子物質(zhì)自身可以吸收特定光波的能量后，依賴發(fā)出熒光的特性而建立的一種方法；濁度法是利用測(cè)定不同濃度的稀懸浮液，在不被吸收的光波長(zhǎng)條件下，測(cè)定其表觀吸光值而建立的一種方法。
將待測(cè)物(如核酸、蛋白質(zhì))配制成一定濃度的溶液后，注入石英杯，移至相應(yīng)波長(zhǎng)的分光光度計(jì)中，即可從測(cè)定的吸光值換算出待測(cè)物的含量。
1 紫外光譜法
1）測(cè)定核酸含量構(gòu)成核酸的堿基組分是分光光度計(jì)測(cè)定核酸含量的依據(jù)。在波長(zhǎng)260nm測(cè)定過程中，DNA或RNA溶液濃度的增高或降低，會(huì)使其吸光值(A260)隨之發(fā)生增高或降低變化，二者之間呈正比關(guān)系。通常1個(gè)A260分別相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA、37μg/ml單鏈DNA和40μg/ml單鏈RNA。另外，用A260/A280可確定DNA和RNA的純度(純DNA和純RNA的比值分別為1 8和2 0)，當(dāng)此比值分別小于1 8和2 0時(shí)，表明樣品中已污染了蛋白質(zhì)或酚類等物質(zhì)。
2）測(cè)定蛋白質(zhì)的含量及純度蛋白質(zhì)(包括酶和肽)溶液的A280主要是由構(gòu)成蛋白質(zhì)組分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的吸光值決定的，胱氨酸(Cys)的貢獻(xiàn)很小。大腸桿菌RNA聚合酶σ32因子及其Tyr、Trp和Cys的摩爾吸光系數(shù)和氨基酸含量見表11。
由表11中數(shù)據(jù)可見，其摩爾吸光系數(shù)與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的很相似。所謂摩爾吸光系數(shù)是指某物（如BSA）在1mol/L 濃度時(shí)，置特定波長(zhǎng)（如280nm）下測(cè)定出的吸光值，對(duì)一個(gè)純物質(zhì)來說，該值在特定條件下應(yīng)該是個(gè)恒定值。同樣百分吸光系數(shù)(某物在1%濃度時(shí)，特定條件下所測(cè)定的吸光值)無疑也是個(gè)恒定值。不同物質(zhì)因結(jié)構(gòu)的差異性或Tyr、Trp等氨基酸含量的不同，測(cè)出的吸光系數(shù)也各不相同。
2 可見光光譜法
將待測(cè)物(如蛋白質(zhì)、核酸、糖類)與相關(guān)試劑(表12)或酶的底物作用后，注入玻璃杯，根據(jù)呈現(xiàn)的顏色或形成的產(chǎn)物特性，移至相應(yīng)波長(zhǎng)的分光光度計(jì)中，即可從測(cè)定的吸光值換算出待測(cè)物的含量。例如，鄰苯二酚(275nm有吸收峰)在鄰苯二酚2，3雙加氧酶的作用下，可轉(zhuǎn)化為黃色的α羥基粘康酸半醛(375nm有吸收峰)，通過檢測(cè)375nm吸光值的升高，即可換算出所用酶的活性單位。
另外，還可用不同吸光值之間的比值鑒定某些物質(zhì)的純度。例如，純細(xì)胞色素c還原型A550/氧化型A280為1 25～1 28。假如比值過高或過低，就表明細(xì)胞色素c被污染。
3 熒光光譜法
熒光光譜法的精確性、重復(fù)性和靈敏度比吸收光譜法好。當(dāng)分析物含量低、用吸收光譜法不能檢測(cè)時(shí)， 改用熒光光譜法卻能求得滿意結(jié)果。例如，NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的連鎖反應(yīng)是由于NADH2和NADPH2發(fā)熒光，因此它們可用于偶聯(lián)NADH2(或NADPH2)的氧化或 NAD(或NADP) 的還原反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行熒光測(cè)定。通常谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamicoxaloacetic transaminase，GOT)活性測(cè)定，是采用與蘋果酸脫氫酶(malicdehydrogenase，MDH)相偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行：
4 濁度法
通過測(cè)定某物質(zhì)的表觀吸光值，即可求出其含量。例如，伴刀豆球蛋白(concanavalin，Con A)的活性測(cè)定方法之一就是采用此法完成的。即將一定濃度的Con A 溶液與糖原反應(yīng)后，可產(chǎn)生相應(yīng)濁度且無沉淀的懸浮液，測(cè)定420nm波長(zhǎng)下的吸光值(A420)，即能求出Con A的活性或濃度，此法也可用于分析培養(yǎng)液中細(xì)菌（如E. coli）生長(zhǎng)的狀況，即定時(shí)取樣，檢測(cè)其波長(zhǎng)600nm的表觀吸光值(A600)，即可求出相關(guān)細(xì)菌的濃度。
（二）電化學(xué)法
有些化學(xué)反應(yīng)過程放出質(zhì)子氫(H+)，可用靈敏的pH計(jì)或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化，從而計(jì)算出欲測(cè)物的含量或活性。例如，葡糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定該酸的含量，便可求出葡糖氧化酶的活性。一種細(xì)菌No 66的脫氯酶能催化單氯乙酸和(或)二氯乙酸釋放出Cl-，使所處溶液的pH降低。這些Cl-的濃度，可用氯離子選擇電極和雙液參比電極進(jìn)行測(cè)定。
（三）生物活性檢測(cè)法
大多數(shù)生命物質(zhì)，尤其是一些激素類物質(zhì)，當(dāng)把它們注射入動(dòng)物的特定器官時(shí)，所屬機(jī)體將發(fā)生相應(yīng)的變化，并且二者間有一定的相關(guān)性。根據(jù)這一性質(zhì)設(shè)計(jì)的方法，即可對(duì)生命活性物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。例如，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)能使小鼠子宮加速增殖，因此通過檢
新書資訊