《分子生物學基本技術實驗指導》共24個實驗，分別介紹了組織或細胞總RNA制備和反轉錄、聚合酶鏈反應、實時熒光定量PCR、質粒重組與鑒定、淋巴細胞的分離等基因克隆技術，以及將所克隆基因進行轉染后的蛋白質表達和轉染細胞功能的檢測等目前在生物醫學研究中比較常用的實驗方法。
《分子生物學基本技術實驗指導》主要供本科高年級及研究生學習使用，以強調分子生物學技術的應用性，同時也可作為青年科技工作者進行科研工作的參考書。
實驗一組織或細胞總RNA制備和反轉錄
一、實驗目的
1.掌握制備細胞或組織總RNA的原理和方法。
2.掌握RNA反轉錄為cDNA的原理和方法。
二、實驗原理
總RNA提取試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。裂解液中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層、中間層和有機層（下層），這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質。整個操作可在1h內完成，提取的總RNA沒有DNA和蛋白質的污染，可用于Northernblot、Dotblot、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆。
三、材料、試劑與儀器
1.材料
2.試劑
新鮮全血。
總RNA提取試劑盒（表1-1）、氯仿、RNA-freeddH2O、反轉錄試劑盒（表1-2）。
表1-1總RNA提取試劑盒內容
2分子生物學基本技術實驗指導
續表
表1-4反轉錄引物的選擇
圖1-1陽性對照簡圖
3.儀器
低溫臺式高速離心機、低溫冰箱、紫外檢測儀、電泳儀、電泳槽、微量移液器、微量移液器吸頭等。
4分子生物學基本技術實驗指導
四、實驗步驟
（一）總RNA提取
**次使用前應在去蛋白液RD、漂洗液RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。
（1）樣品處理如下。
1）組織：將組織在液氮中磨碎。每50～100mg組織加1ml裂解液RZ，用刀漿儀進行刀漿處理。樣品體積應不超過裂解液RZ體積的1/10。
2）單層培養細胞：直接在培養板中加入裂解液RZ裂解細胞，每10cm2面積加1ml裂解液RZ。用移液器吹打幾次。
注意：裂解液RZ的加入量根據培養瓶面積決定，不是由細胞數決定。如果加入量不足，可能導致提取的RNA中有DNA污染。
3）細胞懸液：離心取細胞，棄上清。每5×106～10×106動物細胞或植物細胞加入1ml裂解液RZ。加裂解液RZ前不要洗滌細胞，以免降解mRNA。
4）血液：直接取新鮮血液，加入3倍體積的裂解液RZ（推薦0.25ml血液＋0.75ml裂解液RZ），充分振蕩混刀。
（2）將刀漿樣品在15～30℃放置5min，使得核蛋白體完全分離。
（3）可選步驟：4℃，12000r/min離心5min，取上清，轉入一個新的無RNase的離心管中。
注意：如果樣品中含有較多蛋白質、脂肪、多糖或肌肉、植物結節部分等，可加此步驟離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。
（4）加入200μl氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。
（5）4℃，12000r/min離心10min，樣品會分成3層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，RNA主要在水相中，水相的體積約為所用裂解液RZ的50%。把水相轉移到新管中，進行下一步操作。
（6）緩慢加入0.5倍體積無水乙醇，混刀（此時可能會出現沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR3中，4℃，12000r/min離心30s，若一次不能將全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，可分兩次轉入，再4℃，12000r/min離心30s，棄掉收集管中的廢液。
（7）向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD（使用前請先檢查是否已加入乙醇），4℃，12000r/min離心30s，棄廢液。
（8）向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙
醇），室溫靜置2min，4℃，12000r/min離心30s，棄廢液。
（9）向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室溫靜置2min，4℃，12000r/min離心30s，去除殘余液體。
（10）將吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000r/min離心2min，去除殘余液體
（注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR3在室溫放置片刻，或置于超凈工作臺上通風片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續的反轉錄等實驗操作）。
（11）將吸附柱CR3轉入一個新的離心管中，加30～100μlRNase-freeddH2O，室溫放置2min，4℃，12000r/min離心2min。洗脫緩沖液體積應不少于30μl，體積過小影響回收效率。且RNA應保存在.70℃，以防降解。
注意：如果想提高RNA得率，可重復上步操作一次，合并兩次得到的溶液。
（二）反轉錄
合成的cDNA引物可結合實際情況從OligodT-AdaptorPrimer、Random9mers或特異性下游引物中任選一種。
（1）按表1-5配制反轉錄反應液。
（2）按以下條件進行反轉錄反應。
使用Random9mers進行反轉錄時，首先在30℃下保溫10min，使Random9mers延伸達到足夠長度，以便在42～55℃退火時與模板RNA充分結合。
五、RNA質量的判斷
（一）完整性判斷
通常使用瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整性。理論上，完整的RNA擁有28S∶18S=2.6∶1左右的比例（即相對分子質量之比）。由于大分子rRNA的二級及三級結構程度更高。較小分子的rRNA更容易降解，再加上RNA電泳受許多因素影響，包括電泳條件、上樣量、被EB飽和的程度等，因此準確評估28S∶18S并不容易。另外，來自不同器官組織，在確定其mRNA沒有降解的前提下，其比例也有區別（如肝和肺的比例較低）。可以說，2∶1是高質量的標準，但低于2∶1并不就是質量低。一般的，如果28S和18S條帶清晰，且28S∶18S＞1，該完整性就可以滿足絕大部分后續實驗。如圖1-2所示。
圖1-21%瓊脂糖RNA電泳圖1～3.RNA樣品，28S∶18S=2.6∶1
（二）純度的判斷
260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾
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